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新疆外地輸入豬肉水餃的非洲豬瘟病毒檢測

時間:2019-10-22    點擊: 次    來源:中國動物檢疫    作者:蘇曉慧,任娟等 - 小 + 大

摘要:為進一步加強非洲豬瘟防控工作,新疆開展了非洲豬瘟專項監測排查,2018年12月5日,在公路檢查站攔截的A廠5個批次速凍水餃樣品中,首次檢出非洲豬瘟病毒核酸。為防止攜帶非洲豬瘟病毒的豬肉產品引發疫情,針對公路檢查站、冷庫及超市的豬肉餡水餃進行排查,隨后又在B廠4個批次水餃中檢出非洲豬瘟病毒核酸。這是新疆首次連續集中在外地輸入的豬肉餡水餃中發現非洲豬瘟病毒,說明非洲豬瘟病毒已形成了一定污染面。因此,要加強產地檢疫和屠宰場的實驗室檢測,繼續加大跨省入疆豬肉及其產品的檢查和查處力度,嚴格控制疫區生豬及豬肉產品調入新疆。

非洲豬瘟(ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起的一種急性、烈性豬傳染病,發病率、致死率可高達 100%,危害嚴重,對養豬業可造成毀滅性打擊,可引起巨大的經濟損失和社會影響。ASF自 2018 年 8 月在遼寧省首發以來,已在我國多個省份發生。為進一步加強 ASF 防控,新疆地區加強臨床監視、現場排查,對生豬從生產到屠宰全程進行采樣監測,嚴格控制生豬及其產品調運監管,多部門協調聯動,形成了良好的工作機制。

2018 年 12 月 5 日,新疆巴州若羌縣動物公路檢查站在攔截的袋裝水餃中采集樣品 13 個批次,經新疆動物衛生監督所實驗室檢測,發現 5 個批次呈 ASFV 核酸陽性。隨后,將疑似陽性樣品送中國動物衛生流行病學中心復核,確診為 ASFV 核酸陽性。為進一步了解新疆地區外地輸入豬肉水餃的ASFV 污染情況,在該區其他公路檢查站和冷庫超市開展了 ASFV 排查工作,又連續排查出 4 個批次的外地輸入速凍水餃為 ASFV 核酸陽性。這是新疆地區自 2018 年 9 月開展 ASF 專項排查以來,首次排查出輸入性豬肉制品攜帶 ASFV。

1 材料

1.1 樣品

樣品來源:動物公路檢查站攔截的速凍豬肉餡水餃,其中來源于 A 廠 13 個批次、B 廠 1 個批次;在冷庫、超市中抽檢 B 廠速凍豬肉餡水餃 11 個批次。樣品的采集、保存和運輸嚴格按照《非洲豬瘟監測樣品采集、保存與運輸方法》中的要求,以豬肉產品的批次為采樣單位,每批次按豬肉產品包裝的規格(件 / 箱)隨機抽樣。數量為每批次隨機抽取 10 件(箱),每件(箱)采集樣品 2 份,合計每批次采集樣品 20 份。

1.2 試劑

天根磁珠法病毒 DNA/RNA 提取試劑盒(批號S7327)、DNA 病毒反應液(批號 20181129):購自北京世紀元亨動物防疫技術公司;TaqMan 探針、ASFV 特異性引物、提取陽性對照、反應陽性對照:均由中國動物衛生流行病學中心提供。

1.3 儀器設備

上海博訊電熱恒溫水槽 SSW-600-2S、Bertin Precellys evolution 高通量組織研磨儀、Sigma3K-15臺式冷凍高速離心機、天隆 NP968 自動核酸提取儀、QuantStudio5 實時熒光定量 PCR 儀。

2 方法

2.1 樣品處理

每批次每袋隨機挑取 2~3 個餃子,挑出其中的豬肉進行剪碎。在加有陶珠的組織研磨管中,加入 1 mL PBS 緩沖液,再加入剪碎的樣品約100 mg,使用 Bertin Precellys 組織研磨儀進行勻漿處理。處理后放入 60 ℃水浴鍋滅活 30 min,每間隔 5 min 顛倒混勻樣品 1 次。

2.2 病毒 DNA 提取

對滅活后的樣品 4 ℃ 2 000 r/min,離心 10 min;取 200 μL 上清液,使用磁珠法病毒 DNA 提取試劑盒提取 DNA;將提取的核酸于 ?20 ℃冰箱中保存備用。

2.3 熒光定量 PCR

采用 ASFV 特異熒光定量 PCR 方法擴增ASFV VP72 基因片段。PCR 以 20 μL 體系進行:DNA 病毒熒光反應液 10 μL、ROX 0.2 μL、無菌無核酸水 5.7 μL、正向引物 0.8 μL、反向引物 0.8 μL、TaqMan 探針 0.5 μL,模板 DNA 2 μL。同時,設立提取陽性 / 陰性對照、反應陽性 / 陰性對照。密封反應試管,瞬時離心,放入熒光 PCR 儀,按照熒光 PCR 循環條件擴增。

3 結果

根據 ASFV 檢測操作規程分析,樣品 Ct 值低于 40 為陽性。12 月 5 日檢測的 13 個批次樣品中,有 5 個批次檢測到 ASFV 特異性擴增曲線,Ct 值為 28.3~32.68(圖 1),其他批次熒光定量 PCR 檢測結果見表 2。

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